体外刺激性实验
眼刺激试验是化妆品安全评价的主要测试项目，化妆品引起的局部眼刺激通常包括结膜、角 膜、虹膜和泪腺的作用， 基于体内眼刺激作用发生的机制，目前已开发了多种替代方法。因此，根据角膜损伤的发生机制，结合体外方法的原理和标准化应用程度，根据客户不同需求，为客户提供更专业的眼刺激试验方案。
一．鸡胚绒毛膜尿囊膜实验(HET-CAM)
1.实验目的
测试受试物引起鸡胚绒毛尿囊膜毒性变化的能力，从而客观评估物质潜在的眼刺激性程度。
2.实验原理
鸡胚绒毛尿囊膜试验是一种较早被采用的眼刺激性体外评估方法，是利用鸡胚绒毛膜尿囊膜结构与人结膜相似的特点开发的替代方法。绒毛尿囊膜（CAM）是一个呼吸性膜，包围在鸡胚周围。本试验利用孵化的鸡胚中期绒毛尿囊膜血管系统完整、清晰和透明的特点，将受试物直接接触CAM膜，于5 min之后观察绒毛尿囊膜毒性效应指标（主要为：出血、凝血 和血管融解）的变化，这些指标反映血管及血管网的形态结构、颜色和通透性的变化，以及反映绒毛尿囊膜蛋白质变性等现象及其受损程度，然后组合得到一个评分，用于评估受试物的眼刺激性。
3.评分标准
表 8-4 HET-CAM 评分表
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分值 |
0分 |
1分 |
2分 |
3分 |
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出血 |
无出血 |
轻度出血：仅见细小血管出血和少量出血（如0.5% TexaponASV，作用5min） |
中度出血：小血管和大血管出血，并有明显的血液流出（如1.0% TexaponASV，作用5min） |
重度出血：几乎所有血管都出血，大量血液流出（如5% TexaponASV，作用5min） |
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凝血 |
无凝血 |
轻度凝血：血管内 和/或 血管外轻度凝血，和/或 CAM膜轻度混浊（轻度凝血如0.2% NaOH 溶液作用 5min，轻度混浊如0.3% 乙酸作用5min） |
中度凝血：血管内 和/或 血管外中度凝血，和/或 CAM膜中度混浊（中度凝血如0.3% NaOH 溶液作用5min，中度混浊如3% 乙酸作用5min） |
重度凝血：血管内 和/或 血管外重度凝血，和/或 CAM膜重度混浊（重度凝血如0.5% NaOH 溶液作用5min，重度混浊如30% 乙酸作用5min） |
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血管融解 |
无血管融解 |
轻度血管融解：仅小血管融解（如0.5% TexaponASV，作用5min） |
中度血管融解：小血管和大血管融解（如 1% TexaponASV，作用5min） |
重度血管融解：大血管和全部血束都融解（如 5% TexaponASV，作用5min） |
4.评分附图
a*血管清晰可见，血管正常。
b*血管出血。
c*血管融解。
d*血管凝血。
e*血管重度融解，CAM膜浑浊。
5.刺激性评价
表1. 刺激评分结果评价
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刺激评分IS |
预测分类 Prediction classification |
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IS＜1 |
无刺激性 Non-irritant（NI） |
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1≤IS＜5 |
轻度无刺激性Slightly irritant（SI） |
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5≤IS＜9 |
中度无刺激性 Moderately irritant（MI） |
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IS≥10 |
强刺激性/腐蚀性 Strong irritant/Corrosive（Co） |
终点评分法（ES）：每只鸡胚记分=每只鸡胚观察到的出血、凝血和血管融解程度的和；终点评分（ES）=6 只鸡胚得分的数总和。
表2.终点评分法结果评价
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刺激性分类 |
无/轻刺激性 |
中度刺激性 |
强度刺激/腐蚀性 |
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终点评分 |
ES≤12 |
12＜ES＜16 |
ES≥16 |
二：绒毛膜尿囊膜血管试验(chorioallantoic membrane vascular assay．CAMVA)
是简化了的 HET-CAM方法，只观察受试物暴露CAM 30 min后血管的变化(出血、血管溶解和凝血)，计算使50％ 的鸡胚出现上述损伤的受试物浓度。CAMVA法适 用于轻度到中度眼刺激性化合物的检测，也可正确区分刺激物和非刺激物。